怎样监测病原物抗药性？

因为大多数植物病原菌的致病阶段处于单倍体时期，且繁殖系数大、周期短，所以植物病原菌抗药性是发生速度最快、为害最严重的农业有害生物。同时，病原菌抗药性不容易被农民肉眼识别，必须通过实验室精密测定才能鉴别和诊断，因此，世界各国投入杀菌剂抗性监测研究的人力和财力也最多。

病原物抗药性监测是指测定自然界病原物群体对使用药剂敏感性的变化。包括在各地定点连年系统测定和对有抗药性怀疑的地方临时采集标本测定。最常用的监测方法是测定病原物生长量与药剂的效应关系。常见方法有菌落直径法，即在含有系列浓度杀菌剂培养基上测量药剂对菌落线性增长速率的抑制效应。采用干重法测量在含药的液体培养基中培养的菌体干重增长速率与药剂的效应，更能够准确反映杀菌剂对菌体生长的抑制作用。不过这种方法比较繁琐，工作量大。当病菌以孢子繁殖生长时，亦可采用浊度法测定细胞生长量与药剂的效应。

采用临界剂量或鉴别剂量是检测和测量抗药性广度的常用方法。如在含有完全能抑制野生敏感菌生长的杀菌剂浓度的培养基平板上，涂抹病原物混合孢子或其他繁殖体，进行适当培养后，检查病菌的生长情况，计算抗药性菌株的出现频率。

采用孢子萌发法也可测定药剂对不同菌株孢子萌发的抑制来鉴别抗药性。但是，许多内吸性杀菌剂并不阻止孢子萌发，这时应该考虑对芽管形态和菌体发育的作用。

活体测定法是指把病菌接种到经杀菌剂处理过的植株或部分组织上，评估药剂处理剂量与发病程度间的效应关系。这种活体测定方法不仅是测定专性寄生菌抗药性的唯一方法，而且是验证病菌在培养基上对药剂敏感性差异是否与在寄主上的反应差异一致必不可少的方法。例如，麦角甾醇生物合成抑制剂和二甲酰亚胺类杀菌剂在离体条件下，很容易引起真菌的抗性突变，但是，这些突变体对寄主的致病性也常随之降低。此外，在培养基上能对叶枯唑表现抗药性的稻白叶枯病菌，则失去了致病能力，而在经叶枯唑、敌枯唑等处理的水稻上表现抗性的菌株，在培养基上反而不表现抗性。

已知有些杀菌剂对菌体的呼吸作用或生物合成过程等生命过程有显著抑制作用，可以用生化测定法，测定不同杀菌剂浓度对这些过程影响程度的差异来比较不同菌株的敏感性。或者基于靶标蛋白三维结构变化而丧失与药剂的亲和性抗药性机制，制备和利用单克隆抗体进行免疫检测。最近，也有根据单核苷酸变异而产生抗药性的机制使用DNA探针杂交和PCR指纹图谱等分子生物技术进行病原物抗药性监测的成功例子。定量PCR检测技术的开发和应用，使病原菌的抗药性早期监测和预警成为可能。

一种病原物对某一农药的敏感性还常随着个体的遗传差异、培养基组分、琼脂的质量、温度、pH、测试环境和方法的不一致而有变化。如在含乙磷铝的PDA培养基上，疫霉的生长不受影响，但是在不含磷酸盐的合成培养基上，这种真菌对药剂则变得敏感。因此，某种药剂—病原物组合的抗药性测定，不但要选用适当的方法和条件进行，而且被怀疑有抗药性的菌株也必须用测得敏感基线同样的方法和条件进行各种测试，最好在所有抗药性测定中均包含有一个已知敏感的参考系。

在测定某种病原物各个个体对农药不同浓度的效应后，如何进一步鉴别和评估它们的抗药性，常用的标准有3种：第一种是用同一浓度测定各个体对药剂的反应；第二种是测定最低抑制浓度；第三种是测定产生相同效应的浓度，如抑制菌体生长发育或致病50%的有效浓度（EC50）。

第一种标准常会过高地评估抗药性水平或抗性程度。因为病菌对同一剂量的效应有时差异很大。第二种标准也有缺陷。因为有的菌株抗药性水平很高，如灰霉菌（Botrytiscinerea）对多菌灵的抗药性，难以用最低抑制浓度来评估抗药性水平，有些杀菌剂即使在很高浓度下也不能完全抑制菌体生长，同样不能采用这种分析标准。但灰霉野生敏感菌株对多菌灵特别敏感，亦可用最低抑制浓度作为鉴别抗性和敏感菌株的标准。采用第三种分析标准，根据杀菌剂的剂量与抑制菌体生长发育的效应关系，得出剂量与生长抑制率之间的回归方程，然后根据对测定菌株和标准野生敏感菌株的相同抑制生长发育百分率的药剂浓度的比较，鉴别抗性菌株并分析抗性水平。有些病菌对某些药剂的敏感性是由多个微效基因决定的，表现出数量遗传性状，虽很难评估某一菌株的抗性水平，但可以通过测定某地区用药前病原群体（一般需测100个菌株）对药剂的敏感性分布，用药后再测定病原群体的敏感性，由此可根据平均EC50之比来评估某一地区病原群体的抗性水平。